Die DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung ist die Auflöschung der Reihe von Nukleotiden in einem DNA-Molekül. 

Problemstellung

Die DNA-Sequenzierung als Analyse der DNA-Nukelotidreihe war jahrzehntelang ein ungelöstes Problem, bis Mitte der 1970er Jahre geeignete biochemische oder biotechnologische Techniken entwickelt wurde.

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Die DNA-SEquenzierung

Die DNA-Sequenzierung ist
die Auflösung der Reihe von Nukleotiden in einem DNA-Molekül.

Die DNA-Sequenzierung revolutionierte die Biowissenschaften und führte das Zeitalter der Genomik ein. Seit 1995 wurde das Genom von über 50.000 (Stand 2020) verschiedenen Mikroorganismen mithilfe der DNA-Sequenzierung analysiert. Zusätzlich zu anderen logischen DNA-Ansätzen wird unter anderem die DNA-Sequenzierung verwendet. ebenfalls verwendet, um genetische Krankheiten zu erforschen. Darüber hinaus ist die DNA-Sequenzierung als wesentlicher logischer Ansatz, insbesondere im Zusammenhang mit der DNA-Klonierung, ein entscheidender Bestandteil eines Labors für molekulare organische oder genetische Modifikationen.

PROBLEMSTELLUNG

Heutzutage ist sogar die Sequenzierung ganzer
Genome relativ schnell
und auch sehr einfach.

Die DNA-Sequenzierung als Analyse der DNA-Nukleotidreihe war jahrzehntelang ein ungelöstes Problem, bis Mitte der 1970er Jahre geeignete biochemische oder biotechnologische Techniken entwickelt wurden.

Die Schwierigkeiten bei der Genomsequenzierung sind nicht auf das direkte Lesen der Nukleotidsequenz beschränkt. Abhängig von der Methode werden aufgrund technischer Einschränkungen nur kurze DNA-Bereiche (Überprüfungen) bis zu maximal 1000 Basenpaaren in jeder privaten Sequenzierungsantwort eingelesen. Nachdem die Sequenz tatsächlich erhalten wurde, wird der folgende Primer (mit einer Reihe vom Ende der vorherigen Sequenzierung) erzeugt, der als Primer Walking oder Chromosomenspaziergang für ganze Chromosomen beschrieben wird und auch erstmals 1979 verwendet wurde..

Ein größerer Sequenzierungsjob wie der Humangenomjob, der Milliarden von Basenpaaren sequenzierte, benötigt aus diesem Grund eine Technik, die als Shotgun-Sequenzierung bezeichnet wird. Längere DNA-Bereiche werden zuerst direkt in kleinere Einheiten zerlegt, diese werden dann sequenziert, und auch die Sequenzdetails der privaten kurzen Abschnitte werden dann unter Verwendung bioinformatischer Ansätze direkt zu einer Gesamtsequenz rekonstruiert. Um biologisch relevante Informationen aus den Rohsequenzdaten zu erhalten (als Beispielinformationen zur vorhandenen Genetik sowie deren Kontrollaspekten), wird die Sequenzierung durch die DNA-Serienanalyse eingehalten. Ohne sie hat jede Art von Seriendetails keinen klinischen Wert.


Das Verfahren von Allan Maxam sowie Walter Gilbert von 1977 basiert auf der basenspezifischen chemischen Spaltung der DNA unter Verwendung geeigneter Reagenzien und der anschließenden Trennung der Stücke durch Denaturierung der Polyacrylamidgelelektrophorese. Die DNA ist zunächst an einem 5′- oder 3′-Ende mit radioaktivem Phosphat oder einer nicht radioaktiven Verbindung (Biotin, Fluorescein) signifikant. In vier ver-schiedenen Strategien werden bestimmte Basen dann teilweise (begrenzt) angepasst und von der Zucker-Phosphat-Grundlage der DNA abgespalten. Beispielsweise wird das Basen-Guanin (G) durch das Reagenz Dimethylsulfat methyliert und von entfernt Antazida-Therapie mit Piperidin. Danach wird das DNA-Haar vollständig gespalten.

Bei jedem Verfahren entstehen Stücke unterschiedlicher Größe, deren 3′-Ende tatsächlich immer an bestimmten Basen gespalten wurde. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterteilt die Fragmente nach Länge, wobei Größenunterschiede durch eine Base gelöst werden. Die Sequenz der DNA kann durch Vergleichen der vier Strategien auf dem Gel überprüft werden. Dieser Ansatz ermöglichte es seinen Innovatoren, die Operonsequenz eines Bakteriengenoms zu identifizieren. Der Ansatz wird heutzutage selten angewendet, da er gefährliche Reagenzien erfordert und auch schwieriger zu automatisieren ist als die gleichzeitig entwickelte Sanger-Didesoxy-Methode.

Klassische Methoden

Technik von Maxam
sowie Gilbert
.

Didesoxymethode nach Sanger

Die Didesoxymethode nach Sanger wird zusätzlich als Kettenabbruchsynthese bezeichnet. Es ist eine chemische Technik. Es wurde von Sanger und Coulson um 1975 erstellt und bereits 1977 mit der ersten vollständigen Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174) versehen. Sanger erhielt 1980 den Nobelpreis für Chemie für seine Arbeit zur DNA-Sequenzierung zusammen mit Walter Gilbert und auch
Paul Berg.

Frederick Sanger, ein Pionier der Sequenzierung.
Sanger ist einer der wenigen Wissenschaftler,
die zwei Nobelpreise erhalten haben, einen
für die Sequenzierung von Proteinen und
einen für die Sequenzierung von DNA.

Prinzip der DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode.

dNTP ist das Grundakronym für ein Nucleosid-triphosphat und kann auch für dATP, dCTP, dGTP oder dTTP stehen. ddNTPs sind die äquivalenten Didesoxy-Versionen der dNTPs. Die Konsolidierung eines ddNTP führt zur Beendigung der Polymerisationsantwort. Himmelspunkte am 5′-Ende der Führung stehen für eine Markierung (z. B. eine fluoreszierende Gruppe), durch die die Synthesegegenstände später im Gel sichtbar gemacht werden können. Umgekehrt können zusätzlich radioaktiv identifizierte Nucleosid-triphosphate für die Polymerisationsreaktion verwendet werden..

Beginnend mit einem kurzen Abschnitt einer bekannten Sequenz (Primer) wird zwischen den beiden komplementären DNA-Haaren eine DNA-Polymerase verlängert. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix durch Erhitzen denaturiert, woraufhin Einzelhaare für weitere Behandlungen angeboten werden. In vier oder ähnlichen Strategien (alle bestehen aus den vier Nukleotiden, von denen eines radioaktiv identifiziert wird) ist eine der vier Basen als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) enthalten (dh jeweils ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP ). Diese Kettenabbruch-ddNTPs haben keine 3′-Hydroxylgruppe: Wenn sie in das kürzlich synthetisierte Haar aufgenommen werden, kann die DNA-Polymerase die DNA nicht länger verlängern, da sich das OH-Team am 3′-C-Atom in befindet Die Ladung der Zugehörigkeit zur Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. Aus diesem Grund werden DNA-Fragmente verschiedener Größen hergestellt, die in jedem spezifischen Satz ständig mit genau demselben ddNTP enden (d. H. Nur mit A oder C oder G oder T für jede Charge). Nach der Sequenzierungsreaktion werden die markierten Terminationselemente aus allen Chargen unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese der Länge nach getrennt. Durch Gegenüberstellung der 4 Ansätze kann die Serie nach Belichtung des radioaktiven Gels mit dem Lesen des Fotofilms (Röntgenfilm) fortgesetzt werden. Die passende komplementäre Sequenz ist die Sequenz des verwendeten einzelsträngigen DNA-Layouts. Heutzutage wird eine Variante des Polymerase-Domino-Effekts (PCR) als Sequenzierungsantwort verwendet. Im Gegensatz zur PCR wird nur ein Leitfaden verwendet, so dass die DNA nur linear intensiviert wird.

Eine kontaminierte Methode zur DNA-Sequenzierung durch Übertragung der DNA-Moleküle auf einen Träger während der elektrophoretischen Trennung wurde von Fritz M. Pohl und auch seinem Studienteam in den frühen 1980er Jahren etabliert. Das „Direct-Blot-Electrophoresis-System GATC 1500“ wurde von der Konstanzer Firma GATC Biotech vermarktet. Der DNA-Sequenzierer war z.B. B. im Rahmen der europäischen Genomaufgabe zur Sequenzierung des Chromosoms II der Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Seit Anfang der neunziger Jahre wurden tatsächlich Didesoxynukleosidtriphosphate verwendet, die mit fluoreszierenden Farbstoffen festgestellt wurden. Jeder der 4 ddNTPs ist mit einer anderen Farbe gepaart. Diese Änderung ermöglicht es, alle 4 ddNTPs in ein Antwortgefäß aufzunehmen, eine Aufteilung in verschiedene Sätze sowie die Handhabung von Radioisotopen ist nicht erforderlich. Die resultierenden Kettenabbruchprodukte werden durch Kapillarelektrophorese abgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Stücks zeigen eine Fluoreszenz unterschiedlicher Farben und können daher durch einen Detektor identifiziert werden. Das Elektropherogramm (die Reihe von Schattensignalen, die auf dem Detektor angezeigt werden) zeigt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Haares.

Konzept der DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode.

dNTP ist das allgemeine Akronym für ein Nucleosidtriphosphat und kann auch für dATP, dCTP, dGTP oder dTTP stehen. ddNTPs sind die korrekte Didesoxy-Kommunikation der dNTPs. Der Einbau eines ddNTP wurde verwendet, um die Polymerisationstherapie zu beenden. Die blauen Punkte am 5′-Ende der Führung stellen eine Markierung (z. B. eine fluoreszierende Gruppe) dar, mit deren Hilfe später Syntheseprodukte im Gel hergestellt werden können. Alternativ können Sie auch tatsächlich radioaktiv Nukleosidtriphosphate für die Polymerisationstherapie identifiziert haben.

Moderne Ansätze

Mit der zunehmenden Relevanz der DNA-Sequenzierung in Studien und auch in der Diagnostik wurden tatsächlich Techniken etabliert, die einen erhöhten Durchsatz ermöglichen. Derzeit ist es möglich, das gesamte menschliche Genom in etwa 8 Tagen zu serieren. Die Matching-Ansätze werden als Sequenzierung der 2. Generation bezeichnet. Verschiedene Firmen haben tatsächlich Verfahren mit verschiedenen Vor- und Nachteilen geschaffen. Neben den hier bereitgestellten gibt es noch andere. Die DNA-Sequenzierung der zweiten Generation wurde von der Zeitschrift Nature Techniques als Methode des Jahres 2007 bezeichnet.

Pyrosequenzierung

Wie bei der Sanger-Sequenzierung wird bei der Pyrosequenzierung eine DNA-Polymerase verwendet, um das entgegengesetzte Haar der DNA zu synthetisieren, obwohl die Art der DNA-Polymerase immer noch verschieden sein kann. Die DNA-Kombination wird mit einem DNA-Adapter ligiert und über eine entsprechende Adapterreihe auch mit Körnern gepaart. Die mit DNA gefüllten Perlen werden auf eine Platte mit Poren von der Größe eines Korns gelegt, in der ein Lichtleiter einen Detektor unter jeder Pore verursacht. Die DNA-Polymerase wird sozusagen „bei der Arbeit“ beobachtet, wenn sie zusammen private Nukleotide an ein kürzlich synthetisiertes DNA-Haar bindet. Die erfolgreiche Vereinigung eines Nukleotids wird durch ein fortschrittliches Enzymsystem unter Beteiligung einer Luciferase durch einen Lichtblitz ausgetauscht und auch durch einen Detektor auf Video aufgezeichnet. Die zu sequenzierende DNA fungiert als Themenhaar und ist einzelsträngig. Beginnend mit einem Primer wird das Haar Nukleotid für Nukleotid verlängert, indem unter den vier Arten von Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) eingeschlossen wird. Ein Signal wird erfasst, wenn das richtige (komplementäre) Nukleotid hinzugefügt wird. Wenn ein NTP hinzugefügt wurde, das zu diesem Zeitpunkt nicht übereinstimmt, ist der Lichtblitz nicht zu hören. Anschließend werden die vorhandenen NTPs zerstört und eine zusätzliche Sorte hinzugefügt. dies setzt sich fort, bis eine zusätzliche Reaktion auftritt; Spätestens nach der 4. Verbesserung kommt es zu einer Reaktion, da dann alle Arten von NTP ausprobiert wurden.

Wenn ein komplementäres Nukleotid in der DNA-Polymerase enthalten ist, wird Pyrophosphat (PPi) gestartet. Das Pyrophosphat wird durch die ATP-Sulfurylase in Adenosintriphosphat (ATP) umgewandelt. Das ATP steuert die Luciferase-Antwort, die Luciferin in Oxyluciferin umwandelt. Dies führt anschließend zu einem wahrnehmbaren Lichtsignal, dessen Ausdauer proportional zum aufgenommenen ATP ist.

 

Die Pyrosequenzierung wird zum Beispiel verwendet, um die Regelmäßigkeit bestimmter genetischer Anomalien (SNPs, Einzelnukleotidpolymorphismus) festzustellen, z. B. zur Untersuchung angeborener Erkrankungen eingesetzt. Die Pyrosequenzierung ist einfach zu automatisieren und eignet sich für eine sehr parallele Analyse von DNA-Beispielen.

Ionenhalbleiter-DNA-Sequenzierungssystem

Das Verfahren von Ion Gush verwendet Halbleiterverfahren, um eine nichtoptische sofortige Genomsequenzierung unter Verwendung eingebauter Schaltungen durchzuführen. Die Sequenzierungs-informationen werden direkt aus der Entdeckung von Ionen durch Halbleiterchips gewonnen, die von templatabhängigen DNA-Polymerasen erzeugt werden. Der dafür verwendete Chip verfügt
über ionensensitive Flächeneffekttransistorsensoren, die in einem Gitter von 1,2 Millionen Vertiefungen organisiert sind, in denen die Polymeraseantwort auftritt. Dieses Gitter ermöglicht die parallele
und auch synchronisierte Erkennung unabhängiger Sequenzantworten. Es wird die komplementäre Stahloxid-Halbleitertechnologie (CMOS) verwendet, die eine kostengünstige Reaktion mit einer hohen Dicke von Messpunkten ermöglicht.

 

Sequenzierung mit Brückensynthese

Während der Sequenzierung mit Brückensynthese durch Solexa / Illumina wird die zu sequenzierende doppelsträngige DNA an beiden Enden mit einer anderen Adapter-DNA-Sequenz ligiert. Die DNA wird dann nach Verdünnung denaturiert, einzelsträngig auf eine Versorgerplatte ligiert und das Sitzen durch Brückenverstärkung verbessert. Dies führt zu privaten Orten (Sammlungen) mit kopierter DNA auf der Trägerplatte, die innerhalb einer Sammlung die gleichen Serien aufweisen. Bei einer Sequenzierung durch Synthese-bezogene PCR-Reaktion mit vier auf unterschiedliche Weise getönten Substraten zum Absetzen der fluoreszierenden Kette wird die in jeden Zyklus integrierte Nukleobase in Echtzeit in einem Cluster ermittelt.

 

E2-Basen-Sequenzierung

Ein klar erkennbares Signal kann auch erhalten werden, indem zunächst kurze DNA-Stücke und am Ende einer DNA-Sequenz (Combined End Tag Sequencing, ANIMALS) produziert werden, wenn das Genom tatsächlich bereits vollständig sequenziert wurde.

Sequenzierung der dritten Generation

Die Sequenzierung der dritten Generation bestimmt zum ersten Mal die Reaktion in bestimmten Partikeln als Einzelmolekül-experiment, wodurch die Notwendigkeit einer PCR-Verstärkung vor der Sequenzierung entfällt. Dies verhindert eine ungleichmäßige Amplifikation durch thermostabile DNA-Polymerasen, da Polymerasen bevorzugt einige DNA-Sequenzen binden und diese auch duplizieren viel extremer (Polymerase-Veranlagung).
Dies kann dazu führen, dass einige Sequenzen vernachlässigt werden. Das Genom privater Zellen kann ebenfalls betrachtet werden. Die Aufzeichnung des gestarteten Signals wird in Echtzeit auf Band aufgezeichnet. Bei der DNA-Sequenzierung der dritten Generation werden je nach Ansatz zwei verschiedene Signale auf Video aufgezeichnet: gestartete Protonen (als Variation der Halbleiter-sequenzierung) oder Fluorophore (mit Fluoreszenzdetektor). Die DNA- und auch RNA-Sequenzierung privater Zellen wurde von der Zeitschrift Nature Methods als Ansatz des Jahres 2013 bezeichnet.

Nanoporen-Sequenzierung

Die Nanoporensequenzierung basiert auf Modifikationen des Ionenstroms mit Nanoporen, die in einer künstlich entwickelten Membran installiert sind. Als Nanoporen werden sowohl biologische (kleine transmembrangesunde Proteine, die einem Ionennetzwerk ähnlich sind, z. B. α-Hämolysin
(α-HL) oder ClpX) als auch künstliche Poren (aus Siliziumnitrid oder Graphen) zusammen mit halbsynthetischen Poren verwendet. Die Nanopore wird in eine hergestellte Membranschicht eingebaut, die einen besonders hohen elektrischen Widerstand aufweist. Im Gegensatz zu Standardionennetzwerken ist die Pore vollständig offen und ermöglicht somit auch einen konstanten Ionenfluss über die Membran, nachdem eine Kapazität tatsächlich genutzt wurde. DNA-Partikel, die sich durch die Pore bewegen, senken den Strom. Dieser bestehende Rückgang hat eine Amplitude, die für jedes einzelne Nukleotid spezifiziert und die gemessen und dem entsprechenden Nukleotid zugeordnet werden kann. Bei der Einzelstrangsequenzierung wird ein doppelsträngiges DNA-Haar durch eine Helikase getrennt und ebenfalls in die Nanopore eingebracht. Wenn es um eine MspA-Pore geht, befinden sich gleichzeitig vier DNA-Nukleotide in der Pore.

Die Durchgangsgeschwindigkeit hängt unter anderem von der Unterscheidung des pH-Werts auf beiden Seiten der Membran ab. Die Details, die Modifikationen für jedes der vier Nukleotide darstellen, ermöglichen das Lesen der Reihe aus dem erhaltenen Informationssatz. Eine Analyse erfolgt z.B. B. mit dem Softwareprogramm Poretools. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie auch bei langen DNA-Strängen eine konstante Präzision aufweist. Eine Änderung der Methode wird für eine gesunde Proteinsequenzierung verwendet.

Die Innovation der Nanoporen-Sequenzierung wird beispielsweise von der britischen Firma Oxford Nanopore Technologies beworben. Ihr „MinION“ -Sequenzer war ursprünglich nur über einen angeblichen „Early Gain-Zugang zum Programm“ zugänglich, war jedoch seit 2015 mit Standard-Vertriebsnetzwerken verfügbar.


Das 5,386-bp-Genom des Bakteriophagen φX174. Jeder farbige Block repräsentiert ein Gen.

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